Messmethode für Mais-Aflatoxin
Aflatoxin, abgekürzt AFT im Englischen, ist eine Verbindung, die aus einem Difuranylring und Cumarin (Oxanaphthochinon) besteht. Es wird von Stämmen wie Aspergillus flavus und Aspergillus parasiticus produziert, mit einem Molekulargewicht von 312-346 und einem Schmelzpunkt von 200-300 °C. Es hat stabile und hochtemperaturbeständige Eigenschaften und kann unter langwelligem ultraviolettem Licht Fluoreszenz erzeugen. Es wird in B1, B2, G1, G2, M1, M2, P1, R1, GM und toxische Alkohole unterteilt, je nach Fluoreszenzfarbe, RF-Wert und Struktur.
AFT ist in Wasser, Ethan, Ether und Petrolether unlöslich, aber leicht löslich in organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Ethanol, Chloroform, Acetonitril und Dimethylformamid. AFT kann sich in sauren Lösungsmitteln mit einem pH-Wert von 1-3 leicht zersetzen, sich in Lösungen mit einem pH-Wert von 9-10 schnell zersetzen und aufbrechen, sich bei Einwirkung von Alkali schnell zersetzen und sich in alkalischen Lösungen mit einem pH-Wert von 9-10 in fast ungiftige Salze zersetzen. Es kann unter sauren Bedingungen reduziert werden.
Ziel der Untersuchung
Aflatoxine sind hochgiftige karzinogene Substanzen, die von Pilzen produziert werden. Kurzfristige Aufnahme hoher Dosen (1 mg/kg Körpergewicht) kann zu akuten Vergiftungen führen, mit Symptomen wie Fieber, Erbrechen, Gelbsucht oder Lebernekrose. Langfristige Exposition gegenüber niedrigen Dosen (20 Mikrogramm/kg Körpergewicht) kann das Risiko für Leberkrebs, Magenkrebs und andere Krankheiten erheblich erhöhen. Da sie in Feldfrüchten und Lebensmitteln weit verbreitet sind und für Menschen und Tiere großen Schaden anrichten, ist die Entwicklung schneller und genauer Nachweismethoden für die Lebensmittelsicherheit und die öffentliche Gesundheit von großer Bedeutung.
Das Ziel dieser Untersuchung ist es, das Prinzip des Festphasen-Enzym-Immunoassays (ELISA) zu nutzen, um den Gehalt an Aflatoxin B1 in Proben zu begrenzen und zu quantifizieren und so eine wissenschaftliche Grundlage für die Risikobewertung von Lebensmittelkontaminationen zu schaffen.
Experimentelle Geräte
ST-2000A Mykotoxin-Analysator
Mais, Homogenisator, Stickstofftrockner, Schüttler, Zentrifuge, Messpipette, Waage (Empfindlichkeit 0,01 g), Mikropipette, Methanol, n-Hexan, Chloroform oder Dichlormethan-Reagenz
Experimentelles Verfahren
Überprüfen Sie die im Experiment verwendeten Geräte, um sicherzustellen, dass sie sauber, trocken und frei von Verunreinigungen sind.
Mischen Sie Methanol und deionisiertes Wasser im Verhältnis 7:3, um die Probenextraktionslösung herzustellen.
Nehmen Sie 2 g zerkleinerte Maisprobe und geben Sie sie in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 5 ml Probenextraktionslösung hinzu und schütteln Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4000 U/min für 10 Minuten. Nehmen Sie anschließend 0,5 ml Überstand und geben Sie 0,5 ml deionisiertes Wasser hinzu. Gut mischen.
Entnehmen Sie die benötigten Reagenzien aus dem 4 °C gekühlten Bereich, lassen Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur äquilibrieren und schütteln Sie sie gut. Nehmen Sie die benötigte Anzahl von Mikrotiterplatten und Rahmen heraus und verdünnen Sie die 20-fach konzentrierte Waschflüssigkeit mit deionisiertem Wasser, um die Arbeitswaschflüssigkeit herzustellen.
Beschriften Sie die entsprechenden Mikrotitervertiefungen der Probe und des Standards sequenziell, machen Sie für jede Probe und jeden Standard 2 parallele Vertiefungen und notieren Sie die Positionen der Standard- und Probenvertiefungen. Geben Sie 50 µl/Vertiefung Standard oder Probe in die jeweiligen Mikrotitervertiefungen, dann 50 µl/Vertiefung Enzymmarker und dann 50 µl/Vertiefung Antikörper-Arbeitslösung. Verschließen Sie die Platte mit einer Abdeckfolie, schütteln Sie sie 5 Sekunden lang sanft und mischen Sie gut. Inkubieren Sie bei 25 °C für 30 Minuten.
Entfernen Sie die Abdeckfolie, schütteln Sie die Flüssigkeit aus den Vertiefungen und waschen Sie sie gründlich 5 Mal mit 250 µl Arbeitswaschmittel pro Vertiefung, mit einem Intervall von 30 Sekunden zwischen jeder Wäsche. Tupfen Sie sie mit saugfähigem Papier trocken.
Geben Sie die Substratlösung A (50 µl) in jede Vertiefung, gefolgt von Substratlösung B (50 µl). Schütteln Sie 5 Sekunden lang und mischen Sie gut. Inkubieren Sie bei 25 °C im Dunkeln für 15 Minuten.
Geben Sie 50 µl Stopplösung in jede Vertiefung, schütteln Sie sanft und mischen Sie gut, um die Reaktion zu stoppen.
Messen Sie den Absorptionswert jeder Vertiefung bei 450 nm mit einem Aflatoxin-Analysator (doppelte Wellenlänge 450/630 nm wird empfohlen). Die Messung sollte innerhalb von 10 Minuten nach Beendigung der Reaktion abgeschlossen sein.
Das Instrument schließt die Messung ab und liefert automatisch das Ergebnis
Experimentelle Ergebnisse
Nach der Prüfung beträgt der Aflatoxingehalt der Probe etwa 0,19 µg/kg, was dem GB 2761-2017 "Nationaler Standard für Lebensmittelsicherheit für Grenzwerte von Schimmelpilzgiften in Lebensmitteln" entspricht.